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    本發明特別係關於一種單離的脂質化多肽，其包括一位於N-端之脂質部分與複數個抗原表位，以及關於該多肽之製造方法與用途。
    公开号:TW201300405A
    申请号:TW100141412
    申请日:2011-11-14
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Chih-Hsiang Leng；Chi-Ling Tseng；Hsueh-Hung Liu；Shih-Jen Liu；Hsin-Wei Chen；Pele Choi-Sing Chong
    申请人:Nat Health Research Institutes；
    IPC主号:A61K39-00
    专利说明:
    脂質化多抗原表位疫苗
    本發明特別係關於一種單離的脂質化多肽，特別係關於一種包括一位於N-端之脂質部分與複數個抗原表位的脂質化多肽，以及關於該多肽之製造方法與用途。
    利用從病原菌鑑定得之抗原表位做為標靶抗原，是一項用於研發治療性疫苗的重要策略。以多抗原表位進行免疫，能提供較單一抗原表位疫苗更多的優點。至今，多抗原表位疫苗之發展已聚焦在DNA疫苗。然而，關於DNA疫苗，仍存在有各種安全性方面的疑慮。故有需要研發出能夠克服DNA疫苗障礙之多抗原表位疫苗。
    本發明係基於發現，含有複數個抗原表位的脂質化多肽，當投藥給一個體時，能夠在該個體內誘發免疫反應。
    於一方面，本發明係提供一種單離的脂質化多肽，其包含一位於N-端之脂質部分及複數個抗原表位。該每一複數個抗原表位可能互不相同。於某些具體實施例，該複數個抗原表位全部皆為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原表位。
    該複數個抗原表位可全部皆源自單一種病原菌，例如得自人類乳頭狀瘤病毒(HPV)。在有些實例中，該複數個抗原表位包括一或多個位於E6或E7上之抗原表位。於某些實例，該複數個抗原表位包括HPV血清型-16及血清型-18之HLA-A2-特異抗原表位，例如一或多種或所有選自表1所列的肽類。於某些具體實施例，該等複數個抗原表位為相互鄰接的或不鄰接的。於某些具體實施例，該多肽為重組脂質化A21618-D47(rlipo-A21618-D47)或重組脂質化A21618-SDSk(rlipo-A21618-SDSk)。
    於另一方面，本發明係關於一種包含前述脂質化多肽之組成物。
    於又一方面，本發明亦提供一種製造脂質化多肽之方法。該方法包含：提供一大腸桿菌宿主細胞，其具有一包括編碼一多肽之核酸的表現載體，該多肽包含一細菌脂蛋白訊號肽區與複數個抗原表位；以及將該大腸桿菌宿主細胞進行培養，以使其表現出呈現脂質化形式的多肽，藉此製得該脂質化多肽。於某些具體實施例，該核酸係經過密碼子最適化以供在大腸桿菌中表現。於某些實例，該脂蛋白訊號肽區包含Ag473之D1功能域。
    於又另一方面，本發明係關於一種於個體中引發免疫反應之方法，該方法包含將一種包含脂質化多肽之組成物投藥予該個體。免疫反應可為一種由CTL-介導之免疫反應。
    本發明亦關於一種治療人類乳頭狀瘤病毒(HPV)-關連疾病之方法。該方法包含將一有效量之包含本發明所述脂質化多肽的組成物投藥予一有其需要之個體。
    本發明亦包括前述之脂質化多肽或組成物用於，在個體中引發免疫反應或治療HPV-關連疾病的用途。
    “抗原”係指一種含有一或多個會刺激宿主的免疫系統，而使其產生體液性及/或細胞性抗原-專一性反應之抗原表位的分子。術語“抗原”可與“免疫原”交替使用。當“抗原”和適當的細胞接觸後，其會誘發敏感狀態或免疫反應，而以可論證的方式，於活體內或活體外與該受敏化之個體的抗體或免疫細胞進行反應。“抗原”能夠專一地被生物體內的抗體辨識及結合。與主要組織相容性複合體(MHC)結合之抗原，亦能夠被位於T淋巴細胞(T-細胞)表面上的受體辨識及結合，而促使該等T-細胞活化。
    術語“抗原表位”用於本文意指，位於抗原上而被抗體或免疫細胞(例如，B-細胞及T-細胞)辨識的部位。術語“抗原表位”用於本文可與“抗原決定基”或“抗原決定部位”交替使用。細胞毒性T-細胞(CTL)抗原表位意指，能夠活化CTL(已知亦稱做Tc或殺手T細胞)，並接著刺激CTL反應(亦即，誘導異常細胞(例如，受病毒感染之細胞或腫瘤細胞)死亡)的抗原表位。CTL抗原表位(代表性地包括8-11個胺基酸殘基)可與存在抗原-展現細胞表面上之特定第I類MHC分子(包括一重鏈與一β2微球蛋白)形成複合體。此複合體，在與CD8T細胞(一種CTL)結合時會活化該T細胞，而因此引起CTL反應。
    術語“免疫反應”或“免疫原性反應”意指，個體之免疫系統在對於某一抗原之反應過程中所發生的任何反應。脊椎動物之免疫反應實例包括(但不限定於)製造抗體、誘發細胞-介導之免疫作用、補體活化及發展出免疫耐受性。對於後續由同一抗原之刺激所產生的免疫反應(又稱之為次級免疫反應)，可能會比初級免疫反應之情況更為快速。
    “個體”係指人類或非人類動物。非人類動物之實例包括所有脊椎動物，例如哺乳動物如非人類靈長類(特別是指高等靈長類動物)、狗、齧齒類(例如小鼠或大鼠)、天竺鼠、貓等，及非哺乳類動物如鳥類、兩棲類等。於一項較佳的具體實施例，個體係指人類。於另一具體實施例，個體為實驗動物或適合做為某種疾病模式之動物。
    術語“治療”用於本文意指，將包含一或多種活性劑之組成物施用或投藥予個體(其罹患某種疾病、具有該疾病之症狀或有容易罹患該疾病之傾向)，以達到治療、治癒、改善、緩和、改變、矯正、減輕、改善或影響該疾病、該疾病之症狀或容易罹患該疾病的傾向之目的。“有效量”用於本文意指，各活性劑欲給予該個體治療功效時所需之量，單獨或與一或多種其他活性劑組合。有效量(如習於該項技藝人士所認知)係隨著投藥途徑、賦形劑之使用及是否與其他活性劑共同使用而有所改變。
    術語“經單離”用於本文在引述一多肽時係意指，其實質上已與天然締合之分子分離的多肽；換句話說，其純度至少達60%(亦即，約65、70、75、80、85、90、95或99%)，以乾重計。純度可藉由任何適當方法，例如管柱層析術、聚丙烯醯胺凝膠電泳術及HPLC進行測量。
    術語“脂蛋白訊號肽”或“脂質訊號肽”意指，一段存在於天然脂蛋白或其變異型之上，而經發現有助於使一N-端帶有該訊號肽之多肽進行脂質化的肽類。
    於以下說明及附屬之圖式，將詳細列述本發明之一或多項具體實施例。本發明的其他特徵、目的與優點，將從該等詳細描述與圖式，以及從申請專利範圍顯而易見。
    以下係描述其包括一位於N-端之脂質部分與複數個抗原表位的脂質化多肽，以及彼等之製造與使用方法。
    本發明之脂質化多肽包括複數個，例如至少兩個抗原表位。存在脂質化多肽中之抗原表位為相互鄰接的，或是由連結肽胺基酸序列分隔開。每一存在於脂質化多肽之連結肽可為相同或相異。連結肽可包括至多8個(例如，1、3、6或8個)胺基酸。熟悉該項技藝具有通常知識者可了解，可能存在有許多種抗原表位及連結肽結構。
    脂質化多肽之抗原表位可為，任何於該項技藝中已知的抗原表位。使用該項技藝中已知之方法鑑定得之抗原表位，亦可用於產生脂質化多肽。存在某一特定脂質化多肽中之多數個抗原表位，可全部皆來自相同的病原菌。於某些具體實施例，該複數個抗原表位為CTL抗原表位。可用於本發明之例舉性抗原表位包括，該等經敘述於美國專利申請案公開號2009/0117123、美國專利申請案12/787,539、Duraiswamy等人(2003,J. Virology. 77:7401-10)及Lutzky等人(2010,J. Virology. 84:407-417)中者。
    本發明之脂質化多肽可以合成型多肽或重組型多肽之形式獲得。可將脂蛋白訊號肽或脂質訊號肽，藉由習知重組技術連接到標靶多肽(例如，含有複數個抗原表位的多肽)上而形成一種融合蛋白質，其於大腸桿菌中被表現時係呈脂質化形式。脂蛋白訊號肽之實例包括該等經敘述於美國專利案公開號2009/0221499者。
    舉例而言，係將一編碼脂蛋白訊號肽之DNA片段，與一編碼標靶多肽之DNA片段，插入一表現載體(其較佳地帶有強啟動子，例如T7、T5、T3或SP6)中，而構築得一種表現質體。該強啟動子可為可誘導性，例如可被異丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)誘導。然後再將該表現質體導入大腸桿菌宿主菌株中，並將陽性轉形株培養於適合蛋白質表現之條件下。較佳地，該大腸桿菌宿主菌株係對於因過度表現外源性蛋白質，而被誘發的毒性作用具有抗性。此類大腸桿菌株可經由於美國專利案號6,361,966中所描述之方法鑑定或產生。此等大腸桿菌株之實例包括(但不限定於)C43(DE3)(ECCC B96070445)、C41(DE3)(ECCC B96070444)、C0214(DE3)、DK8(DE3)S(NCIMB 40885)及C2014(DE3)(NCIMB 40884)。
    較佳地，係將經此所表現得之融合蛋白質從大腸桿菌宿主細胞分離出，並且經由該項技藝中已知之方法，例如以抗-脂蛋白抗體進行之免疫轉漬法，或質譜分析法確認其脂質化狀態。
    可使用之脂蛋白訊號肽包括大腸桿菌吖啶黃素-抗性蛋白E前驅物之訊號肽，及為一種腦膜炎雙球菌(Neisseria Mengitidis) Ag473蛋白之訊號肽。可藉由(例如)用於鑑定存在於天然脂蛋白之訊號肽的方式來鑑定脂蛋白訊號肽(例如，該等列示於DOLOP資料庫者，該資料庫所在網址為mrc-lmb.cam.ac.uK/genomes/dolop/)。亦可使用天然脂蛋白訊號肽之變異型。
    本發明亦描述一種包含本發明脂質化多肽之組成物。該組成物可根據任一種該技藝中已知之方法製備得。例如，該組成物可含有有效量之本發明的脂質化多肽，及一種醫藥上可接受之載體，例如磷酸鹽緩衝食鹽水、碳酸鹽溶液或佐劑。該載體就其可與組成物之活性成分相容，且較佳地能夠安定化該活性成分，而不會對與接受治療之個體有害等方面的意義而言，必須是“可接受的”。載體之選擇係基於投藥之形式與途徑，以及標準製藥實施程序。適宜之醫藥載體與稀釋劑，以及其所使用之製藥必要物質，係經描述於雷明頓製藥科學(Remington's Pharmaceutical Sciences)。若需要，亦可將佐劑例如霍亂毒素、大腸桿菌熱不安定性內毒素(LT)、脂質體、免疫刺激複合體(ISCOM)或免疫刺激性序列寡去氧核苷酸(ISS-ODN)包括於本發明之組成物中。組成物亦可包括一種有助於活體內遞送之聚合物。參見Audran R.等人，疫苗21:1250-5,2003；及Denis-Mize等人，Cell Immunol.,225:12-20,2003。
    前述之脂質化多肽可用於免疫原性組成物(例如疫苗)中，以供在易受到病原菌感染之個體中產生能對抗該病原菌的抗體及免疫反應。例舉性病原菌包括(但不限定於)人類乳頭瘤病毒(HPV)、C型肝炎病毒(HCV)、伊士坦巴病毒(EBV)、第1型單純皰疹病毒(HSV-1)、第2型單純皰疹病毒(HSV-2)、巨細胞病毒(CMV)、呼吸道融合病毒(RSV)、副流行性感冒病毒第3型(PIV3)、流感病毒、登革熱病毒、西尼羅河病毒、諾羅病毒(Norovirus)及SARS冠狀病毒。
    疫苗之製備方法為該項技藝所熟知，例如揭示於美國專利案；4,601,903；4,599,231；4,599,230及4,596,792。疫苗可製備呈可注射物，呈液體溶液或乳液。本發明之脂質化多肽可與生理上可接受之賦形劑混合。賦形劑可包括水、食鹽水、右旋糖、甘油、乙醇及其組合。疫苗可進一步含有次要量之輔助物質，例如溼潤劑或乳化劑、pH緩衝劑或用於增強疫苗有效性之佐劑。達到疫苗之佐劑功效的方法包括，使用諸如氫氧化鋁或磷酸鋁(礬土)之試劑，一般使用係呈溶於磷酸鹽緩衝食鹽水之0.05至0.1百分比溶液。疫苗可非經腸道投藥，藉由皮下或肌肉內注射。或者，可希望利用其他投藥形式，包括栓劑及口服調配物。對於栓劑，可包括黏著劑與載體，例如聚烷二醇類或三酸甘油酯。口服調配物可包括正常使用之賦形劑，例如製藥級糖精、纖維素、碳酸鎂等類。此等組成物可採取溶液、懸浮液、片劑、丸劑、膠囊、持續釋放調配物或粉末之形式，且含有10-95%之於本文所述的免疫肽。
    疫苗係以與劑量調配物相容之方式，且以治療上有效、具保護性及具免疫原性之量進行投藥。欲投藥之量係取決於欲受治療之個體，包括(例如)個體之免疫系統用以合成抗體，及(若需要)產生細胞-介導之免疫反應的能力。所需要被投藥之活性成份確實劑量，是由醫師的判斷決定。然而，適宜之劑量範圍可由習於該項技藝者容易地，且可依本發明多肽之微生物規則而測定得。亦可利用適合用於初始投藥及追加劑量之療程，但可包括一次初始投藥再接著進行數次後續投藥。疫苗之劑量亦可視投藥途徑而定，並根據宿主的大小而有所變化。
    舉例而言，可鑑定出容易受HPV感染之個體，並投藥予前述之組成物。組成物之劑量將取決於(例如)所使用的特別脂質化多肽、是否有佐劑與該脂質化多肽共同投藥、共同投藥佐劑之類型、以及投藥之形式與頻數，如可由習於該項技藝具有通常知識者測定得。若需要，可重複進行投藥，如可由習於該項技藝具有通常知識者來決定。例如，可於一次初給劑量後，接著施打三次以每週為間隔之追加劑量。可在第一次免疫後4至8週給予追加注射，且可於8至12週，使用相同的調配物給予第二次追加。可從個體採集血清樣本或T-細胞，以測試由該對抗HPV E6或E7蛋白之疫苗所引起的免疫反應。分析對抗某一種蛋白質或感染之細胞毒性T細胞的方法，為該項技藝已熟知。若需要，可給與額外的追加注射。可藉由改變該脂質化多肽之量、組成物之劑量以及投藥的頻數，而將免疫程序最適化，以期引起最大免疫反應。亦可測試該組成物之功效。於一項功效測試中，可將非人類個體經由口服或非經腸道途徑，以本發明之組成物進行投藥。在最初投藥後或在視需要之追加投藥後，將測試個體與對照組個體(接受偽裝投藥)皆以HPV進行攻毒。可使用除了致死以外的終結方式。若接受組成物之個體無HPV感染，或發展出與HPV感染關連之症狀比例較對照組個體低，則決定其具有效性。彼等之差異應於統計學上為顯著的。
    以下之特別實施例僅為例舉說明，並非意欲以任何方式限制本發明揭示之其餘部份。無需進一步詳細描述，據相信習於該項技藝具有通常知識者可基於本文之描述，利用本發明至其最完全程度。所有於本文中引用之公開文獻，皆以其完整性以引用方式納入。 實施例
    針對含有多抗原表位的脂質化多肽是否會誘發抗原表位-專一性免疫反應進行研究。使用數種HPV血清型-16及血清型-18之HLA-A2-特異CTL抗原表位來組成多抗原表位疫苗。將一脂質訊號肽添加至多肽的N-端，而形成脂質化多抗原表位疫苗，rlipo-A21618-SDSk及rlipo-A21618-D47。此等重組多抗原表位疫苗含有HPV血清型-16及血清型-18(彼等為引起子宮頸癌之主要病原菌)的抗原表位。將HLA-A2-轉殖基因小鼠經皮下，以此等脂質化多抗原表位疫苗進行免疫。數據顯示，rlipo-A21618-SDSk及rlipo-A21618-D47皆能在HLA-A2-轉殖基因小鼠體內誘發抗原表位-專一性CTL反應。
    抗原表位之選擇係以先前針對HLA-A2所鑑定得之HPV16與HPV18 CTL抗原表位為基礎。參見下表1。亦選擇位於每一抗原表位兩側翼而延伸出的N-與C-端六個胺基酸。將所有抗原表位及其側翼區域以不同順序連結，而形成A21618-D47與A21618-SDSK。參見圖1及圖2。於A21618-SDSK之實驗例中，亦包括一輔助性T細胞抗原表位(PADRE)、一種小鼠第I類MHC抗原表位、及一源自A型流感基質蛋白之HLA-A2抗原表位。為增進多抗原表位蛋白質在大腸桿菌中的表現，遂根據使用TMHMM、PSORTb與SOSUI軟體之hydropathy分析結果，將某些胺基酸進行改變。將含有訊號肽的脂質區框(lipobox)添加至該等多抗原表位蛋白質的N-端，而形成脂質化多抗原表位。該二種多抗原表位之DNA序列，皆係由PRISMA生技公司於活體外合成得。
    表1.抗原表位之名稱及序列
    使用其中含有一NdeI限制切位之前向引子：5’-GGAATTCCATATGACCCCGACCCTGCA-3’(SEQ ID NO: 13)，及和編碼序列互補且其中含有一XhoI限制切位之反向引子：5’-CCGCTCGAGCGGTTTCTGGCTGCAAATC-3’(SEQ ID NO: 14)，擴增得A21618-D47核苷酸序列。用來擴增A21618-SDSK核苷酸序列之5’引子為：5’-CGGGATCCATGAGCGCGGCGAAATTTG-3’(SEQ ID NO: 15)，而3’引子為：5’-CCGCTCGAGCCACGGACACACAAAG-3’(SEQ ID NO: 16)。將PCR產物選殖到表現載體pET-22b(+)中。為表現蛋白質，將質體轉形入大腸桿菌BL21(DE3)菌株中，並將細菌於37℃下培養過夜。以1 mM之IPTG於37℃下培養3-4小時誘導rA21618-D47及rA21618-SDSK的表現，然後經由離心採收細胞。
    於培養後，將細胞培養物離心(8000 x g下20分鐘)，並將細胞沈澱再懸浮於均質化緩衝液(homogenization buffer)(20 mM Tris-Cl、500 mM NaCl、10%甘油、50 mM蔗糖,pH 8.0)中。將細胞使用French Press(Constant Systems,Daventry,UK)於27 Kpsi下打破，並藉由離心(80,000 x g下40分鐘)淨化細胞沈澱。經誘導之rA21618-D47係以2M尿素/PBS pH 7.2清洗，並使用4M尿素/PBS,pH 7.2從細胞沉澱萃取出。而經表現之rA21618-SDSK係以含有3 M胍鹽酸鹽之均質化緩衝液清洗，並使用含有6 M胍鹽酸鹽之均質化緩衝液從細胞沉澱萃取出。將該二種經萃取之蛋白質使用IMAC管柱(Ni-NTA樹脂)進行純化。利用管柱上摺疊程序(On-column folding procedure)製備不含離液劑(chaotropic agents)之rA21618-D47及rA21618-SDSK的可溶形式。藉由以0.1%之Triton X-114進行管柱上沖洗而去除LPS。於rA21618-D47及rA21618-SDSK中之LPS殘留量低於100 EU/mg。將不含內毒素之蛋白質對PBS透析，以供進行動物實驗。
    為表現rlipo-A21618-D47及rlipo-A21618-SDSK，係將rA21618-D47及rA21618-SDSK之PCR產物，使用BamHI與XhoI切位選殖到表現載體(含有源自rAg473之D1序列的pET-22b(+))中。將表現質體轉形入大腸桿菌C43(DE3)菌株中。將轉形細胞置於LB培養基中，於37℃下進行好氧生長過夜。將過夜培養物以1:25之比例轉移到M9培養基中，並置於震盪培養箱(200 rpm)於37℃下進行好氧生長。以1 mM之IPTG，分別於20℃下培養20小時，及於25℃下培養16小時，來誘導rlipo-A21618-D47及rlipo-A21618-SDSK的表現。藉由離心採收細胞。將收集得之細胞再懸浮於均質化緩衝液中，並以French Press(Constant Systems,Daventry,UK)於27 Kpsi下打破。將含有經誘導之rlipo-A21618-D47及rlipo-A21618-SDSK的細胞沉澱，藉由離心(80,000 x g下30分鐘)淨化，並分別使用20mM Tris(pH 8.9)/1% Triton X-100，及50 mM Tris (pH 8.9)/1% Triton X-100將彼等從細胞沉澱萃取出。將該二種經萃取之蛋白質使用IMAC管柱(Ni-NTA樹脂)進行純化。Triton X-100在純化期間被洗出。藉由以0.1%之Triton X-114進行管柱上沖洗而去除LPS。於rlipo-A21618-D47及rlipo-A21618-SDSK中之LPS殘留量低於100 EU/mg。將不含內毒素之蛋白質對PBS透析，以供進行動物實驗。
    rA21618-D47、rlipo-A21618-D47、rA21618-SDSK或rlipo-A21618-SDSK之胺基酸序列係列示於圖1及2。
    將四組HLA-A2-轉殖基因小鼠(每組隻)分別經皮下投藥予rA21618-D47、rlipo-A21618-D47、rA21618-SDSK或rlipo-A21618-SDSK。每隻小鼠在第0及14天接受兩次30 μg各多肽溶於緩衝液之劑量。於第21天將小鼠犧牲並收集其脾臟。將脾臟過篩於RPMI 1640培養基產生單細胞懸浮液。將細胞懸浮液於1500 rpm下離心5分鐘產生細胞沉澱。將細胞沉澱再懸浮於10 ml之RPMI 1640培養基中，並使用紅血球溶解緩衝液(0.15 M NH4Cl,10 mM KHCO3,0.1 mM Na2EDTA)，於室溫下處理1分鐘而將紅血球溶解。然後將細胞以RPMI 1640培養基清洗，並再懸浮於完全RPMI 1640培養基(補充以10%FBS及由青黴素、鏈黴素與L-麩胺酸鹽之1%混合物的RPMI 1640培養基)中。計算懸浮液中之細胞濃度，並將其調整至濃度為5×106細胞/ml。
    將脾臟細胞以每孔5×105細胞置入平盤，並與10 μg/ml之肽類培養48小時，接著進行加瑪干擾素(IFN-γ)酵素-連結免疫點漬(ELISPOT)分析(eBioscience,聖地牙哥,CA)。將96-孔平盤(於各孔中插入硝基纖維素膜)覆蓋以50 μl抗-IFN-γ抗體溶液(純株AN18，10 μg/ml於1xPBS；購自eBioscience)，並於4℃下靜置反應18小時。將平盤以PBS清洗兩次，然後以每孔100 μl之完全RPMI培養基進行封阻1-3小時，以防止在後續之步驟中發生非專一性結合。接著，將5x105個脾臟細胞與10 μg/ml列於表1之肽類加至平盤中，最終體積為200 μl。對於每一種實驗條件，皆於三重複孔中進行ELISPOT分析。特別地，將平盤靜置於含5% CO2之空氣的濕潤大氣中，於37℃下反應48小時。經此靜置反應後，藉由以溶於PBS之0.05%(wt/vol) Tween 20清洗三次，而將細胞從平盤移出。然後將50-μl等量之生物素化抗-IFN-γ抗體(純株R46A2，2 μg/ml於PBS；購自eBioscience)加入每一孔中。再次將平盤靜置於室溫下反應2小時。重複前述之清洗步驟。於室溫下與親和素-HRP複合體試劑(eBioscience)反應45分鐘後，將平盤再次以溶於PBS之0.05%(wt/vol) Tween 20清洗三次，及單獨以PBS清洗兩次。將100-μl等量之3-胺基-9-乙基咔唑(AEC;Sigma-Aldrich,St. Louis,MO)染色溶液加至各孔，以使染色之點呈色。經4-6分鐘後，藉由將平盤以流動自來水沖洗來終止反應。然後使用ELISPOT計讀機(Cellular Technology Ltd.,Shaker Heights,OH)計算呈色斑點的數目。rlipo-A21618-SDSk及rlipo-A21618-D47皆能在HLA-A2-轉殖基因小鼠體內誘發抗原表位-專一性CTL反應。參見圖3及圖4。 其他具體態樣
    本說明書中所揭示之全部特徵可以任何組合方式組合。本說明書中所揭示之各別特徵可由依相同、相等或類似目的之替代特徵取代。因此，除非另行清楚地指示，所揭示之各特徵僅為一系列同等物或類似特徵之實例。
    從前述之說明，習於該項技藝具有通常知識者可容易地確定本發明之基本特徵，且在未偏離其範圍下，可進行本發明之各種改變與修飾，以使其適於各種不同用途與狀況。因此，於申請專利範圍內亦包含其他具體態樣。
    圖1為列示rA21618-D47(SEQ ID NO:1)及rlipo-A21618-D47(SEQ ID NO:2)之胺基酸序列的圖表。底線標示部分為rA21618-D47之序列。rlipo-A21618-D47包括rA21618-D47之胺基酸序列加一段位於N-端的脂質訊號肽。
    圖2為列示rA21618-SDSK(SEQ ID NO:3)及rlipo-A21618-SDSK(SEQ ID NO:4)之胺基酸序列的圖表。底線標示部分為rA21618-SDSK之序列。rlipo-A21618-SDSK包括rA21618-SDSK之胺基酸序列加一段位於N-端的脂質訊號肽。
    圖3為顯示於HLA-A2-轉殖基因小鼠體內由rA21618-D47及rlipo-A21618-D47誘發之抗原表位-專一性CTL反應的柱狀圖。
    圖4為顯示於HLA-A2-轉殖基因小鼠體內由rA21618-SDSK及rlipo-A21618-SDSK誘發之抗原表位-專一性CTL反應的柱狀圖。
    <110>　國家衛生研究院
    <120>　脂質化多抗原表位疫苗
    <160> 10
    <170> FastSEQ for Windows Version 4.0
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    <400> 16
    权利要求:
    Claims (19)
    [1] 一種單離的脂質化多肽，其包含位於N-端之脂質部分及複數個抗原表位。
    [2] 根據申請專利範圍第1項之多肽，其中該每一複數個抗原表位互不相同。
    [3] 根據申請專利範圍第1項之多肽，其中該複數個抗原表位全部皆為細胞毒性T淋巴細胞(CTL)抗原表位。
    [4] 根據申請專利範圍第1項之多肽，其中該複數個抗原表位全都源自單一種病原菌。
    [5] 根據申請專利範圍第4項之多肽，其中該病原菌為人類乳頭狀瘤病毒(HPV)。
    [6] 根據申請專利範圍第5項之多肽，其中該複數個抗原表位包括一或多個位於E6或E7上之抗原表位。
    [7] 根據申請專利範圍第5項之多肽，其中該複數個抗原表位包括HPV血清型-16及血清型-18之不同的HLA-A2-特異抗原表位。
    [8] 根據申請專利範圍第1項之多肽，其中該複數個抗原表位包括一或多種於表1所列的肽類。
    [9] 根據申請專利範圍第8項之多肽，其中該複數個抗原表位包括所有列於表1的肽類。
    [10] 根據申請專利範圍第1項之多肽，其中該等複數個抗原表位為相互不鄰接的。
    [11] 根據申請專利範圍第1項之多肽，其中該多肽為重組脂質化A21618-D47(rlipo-A21618-D47)或重組脂質化A21618-SDSk(rlipo-A21618-SDSk)。
    [12] 一種組成物，其包含根據申請專利範圍第1項之任一種脂質化多肽。
    [13] 一種製造根據申請專利範圍第1項之脂質化多肽之方法，該方法包含：提供一大腸桿菌宿主細胞，其具有一包括編碼一多肽之核酸序列的表現載體，該多肽含有一細菌脂蛋白訊號肽區與複數個抗原表位；及將該大腸桿菌宿主細胞於可使該多肽以脂質化形式表現的條件下進行培養，藉此製得該脂質化多肽。
    [14] 根據申請專利範圍第13項之方法，其中該核酸序列係經過密碼子最適化以供在大腸桿菌中表現。
    [15] 根據申請專利範圍第13項之方法，其中該脂蛋白訊號肽區包含Ag473之D1功能域。
    [16] 根據申請專利範圍第13項之方法，其進一步包含將該脂質化多肽分離出。
    [17] 一種於個體中引發免疫反應之方法，該方法包含將根據申請專利範圍第12項之組成物投藥予有其需要的個體。
    [18] 根據申請專利範圍第17項之方法，其中該免疫反應為由CTL-介導之免疫反應。
    [19] 一種治療HPV-關連疾病之方法，該方法包含將一有效量之包含根據申請專利範圍第5項之脂質化多肽的組成物投藥予有其需要之個體。
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    法律状态:
    优先权:
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